支原体是一类无细胞壁、呈高度多形态性,能通过细菌滤器,在人工培养基上能生长繁殖的最小原核型微生物。
支原体种类繁多,分布广泛。支原体科分为支原体和脲原体两个属。在支原体属中,对人有致病性的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖道支原体等;而脲原体属中,对人致病的有解脲脲原体。
一、生物学特性1.形态与结构 支原体个体微小,大小约0.2~0.3μm,呈高度多形态,有球形、杆形、分支丝状等。革兰染色为阴性,但不易着色,常用吉姆萨染色,呈淡紫色。无细胞壁是与细菌区别的主要特点。2.培养特性 多数支原体通常在含95%N2、5%CO2的微需氧环境中生长良好。营养要求较一般细菌高。最适pH为7.6~8.0,但解脲脲原体最适pH为5.5~6.5,因其具有尿素酶分解培养基中的尿素产氨,使pH升高,可加速其死亡。支原体有许多特性与细菌L型相似,如多形性、可通过滤菌器、对低渗敏感、菌落呈“荷包蛋”样。二者不同点在于细菌L型在无抗生素等诱导因素作用下,易返祖为原菌,而支原体为独立的一类微生物,不出现返祖现象。
3.生化反应 常以发酵葡萄糖、水解精氨酸和尿素等生物学特性不同,作为初步鉴别支原体的依据。支原体可根据对葡萄糖酵解作用大致分为两类:一类可分解葡萄糖产酸不产气,如肺炎支原体、生殖道支原体;另一类不能分解葡萄糖,但可利用精氨酸产NH3,如人型支原体。解脲脲原体不能利用葡萄糖和精氨酸,但可利用尿素作为能源,分解尿素产碱。4.抗原成分 支原体细胞膜外层蛋白质是主要的特异性抗原。生长抑制试验(GIT)和代谢抑制试验(MIT)是针对此抗原的特异性血清来抑制支原体的上生长,可将支原体分成若干血清型。
二、致病性
主要通过飞沫传播,是人类原发性非典型性肺炎的主要病原体之一。解脲脲原体主要通过性行为传播,是非淋菌性尿道炎的主要病原体之一。
病原学上证实AIDS和HIV患者中存在穿通支原体感染。
三、支原体检验
由于支原体无固定形态,染色结果不易与标本中的组织碎片等杂物区别,故取患者标本直接染色镜检对各种支原体的诊断意义不大。微生物检验方法主要靠分离培养与血清学检查。
(一)肺炎支原体采集咽分泌物、痰、支气管分泌物、胸水等。1.分离与鉴定这是确诊支原体感染的可靠方法之一。常以牛心消化液为基础另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成液体或固体培养基。初次分离生长缓慢,通常先将标本接种于液体培养基中增菌,1周后培养基指示剂颜色改变,液体清晰,可转种于固体平板培养基,在5%CO2环境中培养,初次分离肺炎支原体需1-2周才长菌落。菌落常不出现“荷包蛋”样,需经数次传代后,菌落开始典型。
支原体在固体培养基上长出典型菌落,以此可初步诊断,再进一步进行生化反应和血清学鉴定。生化反应如:
(1)葡萄糖、精氨酸、尿素分解试验。
(2)氯化三苯基四氮唑(TTC)还原试验:使无色ITC还原为粉红色。
(3)生长抑制试验(GIT)和代谢抑制试验(MIT)。
(4)红细胞吸附试验:肺炎支原体的菌落能发生红细胞吸附。2.血清学试验
(1)特异性血清学试验:1)ELISA技术:敏感性和特异性高,可检测IgM和IgG抗体。2)补体结合试验:诊断肺炎支原体常用的血清学方法,主要检测IgM抗体。3)间接血细胞凝集试验:主要检测IgM抗体。
(2)非特异性血清学试验:冷凝集试验,将患者的血清与O型Rh阴性红细胞在下作凝集试验。一般血清滴度≥1:64即为阳性,病程中双份血清至少效价有4倍增长,近期感染可能性越大。3.PCR试验快速检测
(二)解脲脲原体合理采集相应标本,如尿液、前列腺液、精液、阴道分泌物等。
诊断解脲脲原体感染,分离培养是相对容易和快速的。取标本少许接种于含酚红、尿素及血清的液体培养基内,最好在95%N2和5%CO2环境中,37℃孵育,1-2d内即可出现生长现象。取培养物少许(0.2ml左右)转种在相应的固体培养基上,培养48h。
如出现典型菌落,则进行形态观察及生化试验,进行初步鉴定。再进一步利用特异性血清作MIT和GIT试验进行最终鉴定。
可以利用PCR方法鉴定解脲脲原体,其特点是快速、敏感、稳定、可靠。
解脲脲原体的血清学诊断意义不大,主要原因是有些无症状者也可有低效价的抗体。四、人型支原体
人型支原体(M.hominis,Mh)主要寄居于生殖道,21%-53%的性成熟女性子宫颈或阴道内可分离出Mh,男性尿道携带率低。通过性接触传播,可引起盆腔炎、输卵管炎、产后热、阴道炎、宫颈炎及肾盂肾炎等。此外,Mh也能引起新生儿感染,如脑膜炎、脑脓肿、硬脑膜下脓肿等。
形态结构与溶脲脲原体相似,基因组大小为kb,DNA的G+C含量为27.3~33.7mol%。Mh能分解精氨酸,不分解尿素和葡萄糖。培养最适pH为7.2~7.4,对1:的醋酸铊与红霉素(mg/L)不敏感,对四环素和林可霉素敏感。在液体培养基中因分解精氨酸产氨,pH增至7.8以上,易死亡。在固体培养基上菌落大小为40-60μm,个别菌落达-μm,呈典型“油煎蛋”样。
微生物学检验与溶脲脲原体相似。五、穿通支原体
(一)生物学特性菌体形态为杆状或长烧瓶状。大小(0.2~0.4)μm×(0.8~2.0)μm,一端为尖形结构,具有黏附、穿入细胞的作用。营养要求高,培养基中需加血清,在改良的SP-4培养基上生长,菌落呈“油煎蛋”样。生长较慢,初代多在10天以上,发酵葡萄糖,水解精氨酸,但不分解尿素,在液体培养基上生长时,呈透明状,无明显混浊或沉淀。本菌对红霉素、四环素、林可霉素敏感,但对青霉素不敏感。
(二)致病性研究认为穿通支原体、发酵支原体、梨支原体三种新支原体是加速AIDS进程的一个协同因子。年国内学者从AIDS患者尿中分离到1株穿通支原体,从病原学上证实我国AIDS和HIV患者中存在感染。
(三)微生物检验采集咽分泌物、血清、尿液等。1.分离培养选SP-4培养基,每份标本液用改良的SP-4培养基稀释成不同浓度(1:10、1:50、1:),置37℃恒温箱培养,每天观察颜色变化,若由红变黄,透明无沉淀,视“培养可疑阳性”,再用滤膜过滤。滤液转种传代,当培养基颜色再度由红变黄,则认为“初代培养阳性”。2.鉴定1)生化反应:发酵葡萄糖试验、水解精氨酸试验及尿素分解试验。2)代谢抑制试验。3)PCR:此法科可扩增特异性DNA,具有灵敏度高、特异性好及快速的特点。4)抗体检测:国外学者在HIV感染者中用ELISA法检测出大量本菌抗体,其中无症状者的阳性率为20%,艾滋病患者为40%。
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